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2024-03-08 23:00:06

什么是ChIP？——ChIP原理概述 - 知乎

什么是ChIP？——ChIP原理概述 - 知乎首发于生信搬砖简史切换模式写文章登录/注册什么是ChIP？——ChIP原理概述X-Omics中南大学遗传学硕士1.什么是 ChIP ？染色质免疫沉淀法 (ChIP) 是一种基于抗体的技术，可用来选择性地使特异性 DNA 结合蛋白及其 DNA 靶标富集。ChIP 可用来研究某种特殊的蛋白-DNA 相互作用、多种蛋白-DNA 相互作用或全基因组或部分基因内的相互作用。ChIP 使用可选择性地检测和结合蛋白的抗体，包括组蛋白、组蛋白修饰、转录因子、辅因子，以提供有关染色质状态和基因转录的信息。在 ChIP 中结合使用蛋白质组分析和分子生物学技术，能够让研究者理解目的细胞或组织中的基因表达和调节。ChIP-seq实验流程2. 何时使用 ChIP？通常，ChIP 用来检测某种特异蛋白或某种特异蛋白修饰在某个基因组区域的相对丰度。ChIP 可以用来回答大量涉及蛋白和染色质相互作用的科学问题。例如，ChIP 可用来比较某些蛋白在各位点上的存在情况，绘制某个目的基因组区域内的各种蛋白图，或定量能够在受到刺激一段时间后结合诱导基因的蛋白。3.ChIP是如何工作的？ChIP 背后的原理相对较为直接，并依赖于使用一种抗体从细胞或组织提取物蛋白混合物中分离某种蛋白、组蛋白、转录因子或辅因子及其结合的染色质，或使之沉淀。因此，这种技术的名称为：染色质免疫沉淀法。在 ChIP-PCR 或 ChIP-seq 中，使用广泛提供的 PCR 或 qPCR 试剂和下一代测序 (NGS) 技术便能检测和定量免疫富集的 DNA 片段。4. 天然ChIP(N-ChIP)与交联ChIP(X-ChIP)分别是什么？根据实验问题和实验材料，可以进行两种ChIP技术：①天然ChIP(N-ChIP) ；②交联ChIP(X-ChIP)。两种ChIP均有自己的优点和缺点：在 N-ChIP 中，不使用固定剂来使蛋白和染色质交联。相反，从用核酸酶消化的胞核中分离出天然染色质。抗体针对未固定的抗原产生，因此 N-ChIP 的优势在于抗体能更好地检测和结合其靶标抗原。因组蛋白丰度较高，PCR 可能不是下游分析所必需的。虽然这些优势使得 N-ChIP 成为一种颇具吸引力的方法，但它只能用来检测组蛋白。此外，在染色质消化和免疫沉淀步骤期间，蛋白结合丢失可能会使数据出现偏差，或妨碍适当分析。在 X-ChIP 中，使用甲醛等化学固定剂来使目的蛋白和 DNA 交联，并通过声处理或核酸酶消化来进行染色质碎裂。X-ChIP 的优势在于它适用于组蛋白和不是组蛋白的蛋白，并且通常需要的细胞起始材料少于 N-ChIP。X-ChIP 还能在提取期间最大程度减少染色质蛋白丢失的机会，以便检测瞬时蛋白相互作用。沉淀步骤不那么高效，但通过 PCR 达到的 DNA 扩增是下游分析所必需的。5. 有哪些不同类型的 ChIP 实验？一旦完成染色质免疫沉淀，便可对纯化的染色质及有关蛋白、组蛋白、转录因子和辅因子进行多种下游分析。最常见的单基因分析和全基因组分析方法分别是 qPCR 和 ChIP-seq。PCR 和 ChIP-芯片也是下游分析的选择。5.1 ChIP-PCR 有哪些优点？ChIP-PCR 可用来分析基因组中一部分已知靶标位点上的组蛋白修饰和/或蛋白结合情况。在 ChIP-PCR 中，使用广泛提供的 PCR 或 qPCR 试剂和技术可检测和定量免疫富集的 DNA 片段。使用 ChIP-qPCR 可以对多种样品中的特定基因组区域进行快速和定量比较。这比全基因组测序方法更便宜，更省时。5.2 ChIP-芯片（ChIP-chip）有哪些优点？ChIP-芯片技术是指使用一个 DNA 微阵列芯片来分析经 ChIP 免疫富集的 DNA 片段。使用基因组覆瓦式微阵列技术可以对结合分离 DNA 的蛋白进行全基因组分析，并产生一个高分辨率的有关蛋白结合和蛋白修饰的基因组图。ChIP-芯片在基础研究和疾病研究中有多种用途。例如，可用来检测转录因子、增强子和阻遏蛋白的结合位点，并比较对照和病理性样品中的这些结合蛋白种类。但 NGS 的成本大幅下降，并且使用 ChIP-seq 也能获得类似结果，因此更多的人会选择进行 ChIP-seq，而不是 ChIP-芯片。5.3 ChIP-seq 有哪些优点？与 ChIP-芯片类似，ChIP-seq 提供有关全基因组蛋白结合的信息。但不像 ChIP-芯片，ChIP-seq 使用 NGS 技术来检测 DNA 片段，并根据整个基因组将其绘制成图。有了更现代的 DNA 扩增技术，可以在数日之内对少量输入 DNA 进行稳健分析。当起始材料较稀有时，在库制备方法方面取得的这些技术性进展会使 ChIP-seq 实验成为可能。此外，有了使用短序列（称为条形码）独特地标记 DNA 样品的新技术，现在可以将个别片段汇集到一个测序泳道中，以便进行多重分析。这大大提升了 DNA 测序实验的效率，并降低了成本，从而进一步支持 ChIP-seq 应用。合起来，由于 DNA 测序技术方面的进展，ChIP-seq 的优势在于可以在相对较短的时间内，便宜地对大量经 ChIP 富集的 DNA 样品进行测序，同时敏感性和准确性均高于 ChIP-芯片。6. ChIP 实验中有哪些不同的步骤？ChIP 实验要遵循常规实验步骤：蛋白-DNA 交联仅针对 X-ChIP细胞裂解通过消化（针对 X-ChIP 和 N-ChIP）或声处理剪切（仅针对 X-ChIP）来进行染色质碎裂使用特异性抗体进行免疫沉淀清除 DNA 以进行下游分析通过 PCR、qPCR、微阵列或 NGS 进行 DNA 分析重要的是，在决定一个 ChIP 实验是否成功时，每个步骤中的阳性和阴性对照是不可或缺的。ChIP 实验步骤中最关键步骤6.1 ChIP 实验如何交联细胞和组织？使用交联试剂来将蛋白“固定”到它们结合的 DNA 上。以甲醛为基础的试剂通常用来进行这种固定。细胞和组织通常以类似的方式固定，但组织需要更长的固定时间，并且固定的速度更快，以便在靶组织开始变性之前使之快速渗透。除了抑制抗体结合其蛋白靶标，过度固定染色质会降低声处理碎裂的效率。因此，固定时间应根据经验决定，以便最大程度让抗体结合抗原，同时又能使蛋白最佳地交联其靶标 DNA。小鼠心脏 (H)、脑 (B) 和肝脏 (L) 细胞需交联 10 分钟或 30 分钟，如图（左）所示。染色质制备后声处理 4 分钟。使用 SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383 中的指定抗体对用心脏组织制备的染色质进行 ChIP，富集的 DNA 通过使用指定基因引物进行实时 PCR 来进行定量（右）。6.2 如何碎裂染色质？染色质碎裂是成功进行ChIP实验所必需的。染色质碎裂是使染色质可溶并允许其沉淀所必需的。ChIP实验的分辨率取决于染色质碎裂程度，因为DNA片段大小决定ChIP实验的分辨率。酶消化使用微球菌核酸酶 (MNase)，MNase 会剪切核小体之间的双链 DNA，从而产生染色质片段。彻底的 MNase 消化会产生含 150 个碱基对的 DNA 片段（单核小体），不彻底的消化也能产生含150-750bp的 DNA 片段（单核小体、双核小体和三核小体）。声处理使用机械力来碎裂染色质。声处理会碎裂核小体之间和之内的染色质，从而产生150-1000bp的许多染色质片段。对于 X-ChIP，使用酶消化或声处理来剪切染色质。声处理 ChIP 实验步骤中的声处理条件应根据经验决定，因为它们根据细胞类型和实验条件有所不同。消化条件在不同细胞类型和组织之间更一致，但染色质片段大小仍应在免疫沉淀之前进行分析。对于N-ChIP，使用核酸酶来碎裂染色质，以便在未固定的样品中维持蛋白结合。核酸酶碎裂也应根据经验决定，以便最大程度减少染色质过度消化。6.3 为什么要在 ChIP 中使用酶消化？在N-ChIP中必须要使用核酸酶消化，因为蛋白不交联DNA，并且与声处理碎裂有关的苛刻条件会导致染色质蛋白与DNA解离。ChIP非常适合用来分析组蛋白-DNA相互作用，因为组蛋白-DNA结合非常牢固稳定。但N-ChIP不适合用来分析转录因子和辅因子-染色质结合。在 X-ChIP 中，使用酶消化或声处理来碎裂染色质。酶消化的优势包括碎裂一致，碎裂条件温和（低热和去垢剂少），这能更好地保留染色质和抗体表位的完整性，从而使结合转录因子和辅因子的染色质出现免疫富集增强。6.4 为什么在 ChIP 中使用超声处理来碎裂染色质？不像通过酶消化进行的染色质碎裂，声处理依靠机械力来将染色质碎裂成更小的片段。免疫富集的最佳染色质片段大小介于200-1000bp之间。声处理是一种用来碎裂染色质的传统方法，可使用传统的探头式超声仪或声处理更集中的高级水浴超声仪来进行。声处理能产生真正随机的染色质片段，但需要广泛优化不同细胞系和组织，并且难以在实验之间做到重复。需要较多的去垢剂缓冲液，并能在声处理期间产生热，这都会有损染色质蛋白上的染色质和抗体表位的完整性。6.5 优化 ChIP 中的染色质声处理传统上，基于声处理的染色质碎裂使用较多的去垢剂缓冲液，并产生热，这都会有损染色质和抗体表位的完整性。因此，对于不同细胞系和组织，用来碎裂染色质的声处理量必须根据经验决定。必须明确和使用产生150-1000bp的DNA片段的最低声处理量，以便最大程度减少染色质损伤。在通过 qPCR、DNA 芯片或 NGS 进行完整的 ChIP 实验下游分析之前，应使用凝胶电泳法来分析经多次声处理的染色质样品。片段大小决定声处理时间，同时也会随声处理时间延长而减小。但数据表明，更长的声处理时间并不会产生更好的结果。因此，要确定获得所需 DNA 大小并避免不必要的染色质损伤所需要的最低声处理量，在凝胶上处理纯化的免疫沉淀 DNA 并确定最理想的片段大小是一种直接的方法。酶消化的染色质在琼脂糖凝胶上进行处理。1显示消化不足的染色质。2显示消化适当的染色质，而3则显示过度消化的染色质6.6 你如何为 ChIP 选择抗体？选择一种合适的抗体是成功进行 ChIP 实验不可或缺的。在 ChIP 实验中使用的抗体应对目的蛋白具有特异性，并对抗原具有较高的亲和力。ChIP 或 ChIP-seq 实验的最佳抗体是经 ChIP 或 ChIP-seq 验证的抗体。如果没有针对目的基因的经 ChIP 验证的抗体，那么次一点的选择是经免疫沉淀验证的抗体。要注意的是，并不是所有经免疫沉淀的抗体都在 ChIP 中有效，也并非所有经 ChIP 验证的抗体都在 ChIP-seq 中有效。此外，抗体在蛋白印迹、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术和 IHC 等其他应用中验证的程度越高，研究者对抗体性能和特异性就越有信心。在验证抗体之后，必须根据经验决定最佳抗体浓度，以及免疫沉淀洗涤条件。使用 SimpleChIP® 酶解染色质免疫沉淀试剂盒 #9005 对用 4 x 106 个 NCCIT 细胞制备的交联染色质滴定 Ezh2 (D2C9) XP® 兔单克隆抗体 #5246。6.7 如何进行免疫沉淀使用抗体来捕获目的蛋白及其结合的 DNA。抗体浓度应根据经验决定，一般起始点为每 10 μg 染色质 DNA（相当于约 4 x 106 个细胞）使用 0.5-2.0 μg 抗体。缓冲液和洗涤次数的严格程度也应根据经验确定，因为它们会决定抗体对其靶标抗原的亲和力。通常，抗体-染色质孵育要 2 小时至过夜才能完成。抗体-抗原 (+DNA) 复合体在抗体结合树脂上根据亲和力进行捕获。在 ChIP 实验中，这种树脂通常包含偶联蛋白A和/或蛋白B的ChIP级磁性、球状琼脂糖或琼脂糖珠子。抗体结合蛋白A和/或蛋白G珠子的亲和力不同，具体取决于产生抗体的物种以及其重链的IgG亚型。珠子通常用抗体-染色质孵育2-4小时。需要洗涤步骤来去除不结合抗体的染色质，随后解除交联（针对 X-ChIP）并进行 DNA 纯化。此外，必须进行IgG对照免疫沉淀，以确定背景（信噪比）。还必须加入阳性对照抗体（即总组蛋白 H3）和/或阳性对照 qPCR 引物（针对已知的阳性和阴性靶蛋白结合位点），以确定非特异性结合。为获得最佳结果，必须通过 qPCR 对染色质免疫沉淀进行质控，之后再进行下游 NGS 分析。6.8 如何洗脱蛋白 A/G 珠子上的染色质使用去垢剂和热来洗脱蛋白A/G珠子上的染色质。低速“涡旋”或混合是保持珠子悬浮并加强染色质洗脱所必需的。6.9 如何解开染色质交联通过高热和高盐解开交联。此外，还添加蛋白酶 K 来消化有关的染色质蛋白和添加的抗体，以便更高效地进行下游 DNA 纯化。6.10 如何纯化 DNA去除染色质交联之后，使用典型的酚-氯仿及随后的乙醇沉淀方法或使用 DNA 纯化柱试剂盒来进行DNA纯化。7.如何分析富集的 DNA一旦完成了 DNA 纯化，便可进行多种下游分析，包括ChIP-PCR、ChIP-qPCR、ChIP-芯片和ChIP-seq。7.1 ChIP-PCR和ChIP-qPCR分析ChIP-PCR和ChIP-qPCR分析最适合单基因分析，并且可用来以一种快速合算的方式对特定 DNA 片段进行扩增和定量。7.2 ChIP-芯片分析（chip-chip）ChIP-芯片分析使用覆瓦式 DNA 微阵列芯片，绘制一个高分辨率的、有关蛋白结合和蛋白修饰的全基因组图。其用途包括用途：在基因组范围内确定基因转录因子的DNA结合位点和其他DNA结合蛋白或蛋白复合体的DNA结合位点。染色体活性状态的定量分析。组蛋白修饰的功能研究。通过用酰基化或甲基化的组蛋白的特异抗体和没有进行修饰的组蛋白的特异抗体，可以确定与组蛋白修饰有关的结合模式的变化。聚合酶活性的定量分析。精炼生物信息方法，用功能数据来确定启动子的位置。7.3 ChIP-seq 分析ChIP-seq 分析使用标准 NGS 技术来将纯化的 DNA 与之前带注释的全基因组匹配在一起，以检测全基因组蛋白结合分布。具体分析流程可以参考：8.参考染色质免疫沉淀法 (ChIP) 概述 | Cell Signaling TechnologyChIP-seq分析流程(基于linux系统) - 知乎 (zhihu.com)发布于 2021-06-25 22:45生物信息学基因组表观遗传学赞同 1087 条评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录生信搬砖简史为科研路上添砖加

知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP） - 知乎

知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP） - 知乎切换模式写文章登录/注册知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP）小金博士外泌体研究、检测/分子互作、引物/基因合成、测序、蛋白抗体等染色质免疫共沉淀技术（ChIP）基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。染色质免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。今天小编将珍藏多年的ChIP实验心得拿出来与大家一同探讨。应用领域1、判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰2、检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位3、研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系4、转录因子研究技术流程案例展示案例一题目：Hypoxia induces H19 expression through direct and indirect Hif-1α activity, promoting oncogenic effects in glioblastoma期刊：scientific reports主要内容：作者分别使用了两种细胞U87和U251，验证SP1对于H19的转录调控作用。用SP1抗体进行ChIP实验，对H19的启动子区域上游100bp的高GC含量，设计引物。富集到的DNA进行qPCR检测，结果显示SP1能够调控H19启动子的转录。案例二题目：Chromatin Profiling by Directly Sequencing Small Quantities of Immunoprecipitated DNA. 期刊：Nat Methods主要内容：收集培养的5×106K562细胞，使用组蛋白甲基化修饰抗体H3K27me3、H3K4me3、H3K36me3（ChIP-grade）进行IP富集提取的经过片段化的染色质复合物，构建测序文库后进行二代测序，获得peaks在染色质上的分布情况。案例三题目： A crucial role for the ubiquitously expressed transcription factor Sp1 at early stages of hematopoietic specification. 期刊：Development主要内容：分离培养小鼠胚胎干细胞并诱导分化，分别收集组细胞及Flk+细胞，用转录因子Sp1抗体进行ChIP实验后二代测序，获得Sp1结合位点在两种细胞中的分布区域。ChIP经验分享ChIP实验操作性很强，金开瑞根据多年的实践，总结了一些ChIP实验中您可能会遇到的棘手的问题，下面我们就一起来康康吧！细胞固定1、甲醛终浓度为1%较适宜2、固定时间一般为5-60min较好，具体时间根据实验而定染色质断裂1、超声时断时续，保证低温2、注意探头位置，防止产生泡沫3、研究组蛋白需使用酶处理染色质免疫沉淀1、最好有Input对照。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。2、抗体的选择是关键。抗体的选择要注意三点：一是应该选择能够做ChIP实验的抗体。尽量选择ChIP级别商业化的抗体。如没有，一般可以重组到带有标签的载体上，再转染相应的宿主（目前市面上商业化的chip抗体只有300多种，因此正好找到对应抗体较困难，可以选择标签抗体）。二是抗体的结合位点。选择单抗的话，尽量远离抗原和染色质相结合的位点，这样可以最大限度保证抗体和抗原的结合，而多抗可识别多个表位，可基本避免该风险。因此单多抗各有优缺点，应重点关注该抗体是否经过ChIP验证。三是抗体的浓度。抗体浓度的也很重要，浓度太低，不能与靶蛋白完全结合。浓度太高会导致非特异性条带增加背景。3、阴性对照可以使用血清或lgG，阳性对照一般使用RNA Polymerase II或者组蛋白。阴性对照：用实验抗体同型的IgG作为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阴性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带。如果阴性对照样品中的产物量等于特异靶标样品中产物量，说明特异靶标抗体未发挥作用或者染色质断裂不充分。阳性对照：为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3（组蛋白）抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区。因此，理论上ChIP后PCR都会有条带。4、需设计已经确定的、不与特异抗原相结合的DNA片段的引物，用来排除抗原和染色质的非特异结合。交联反应的逆转1、 RNA酶、蛋白酶需65℃保温6小时2、不加蛋白酶可以提取、分析结合蛋白DNA的纯化最好用试剂盒，便于后面的PCR检测DNA的鉴定可以进行二代测序或者qPCR检测结果因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。如果ChIP实验方面有什么问题，欢迎与我们交流哦！实验Q&AQ:ChIP-Seq和ChIP-qPCR有何异同？A:染色质免疫共沉淀（ChIP）所获得的DNA产物，在ChIP-Seq中通过高通量测序的方法，在全基因组范围内寻找目的蛋白（转录因子、修饰组蛋白）的DNA结合位点片段信息；ChIP-qPCR需要预设待测的目的序列，针对目的序列设计引物，以验证该序列是否同实验蛋白结合互作。Q:染色质片段大小在哪个范围比较合适？A:对于ChIP-seq，片段在200-500 bp左右是最合适范围；对于ChIP-qPCR，片段在200-800 bp左右适宜。Q:植物样本处理和动物组织/细胞有何区别？A:植物组织由于细胞壁、气腔等结构的存在，会给交联缓冲液的作用带来困难，因此相对于动物组织/细胞来说，往往需要在抽真空条件下进行交联，而该步奏是一个需要经验及优化的过程。Q:ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量？A:通常是≥10ng。Q:ChIP风险如果判断A:ChIP实验以标签来判断实验风险，重组标签的转录因子＞内源转录因子＞组蛋白；当以重组蛋白作为靶蛋白时，重组蛋白同内源蛋白可能存在结合活性、结合位点差异；以标签抗体进行ChIP时、染色质结合位点本身会被内源蛋白竞争，这些都会影响到ChIP过程的特异性捕获效率。发布于 2020-06-08 14:13免疫分子生物学核糖核酸（RNA）赞同 935 条评论分享喜欢收藏申请

染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项 - 知乎

染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项 - 知乎切换模式写文章登录/注册染色质免疫共沉淀（ChIP）原理及注意事项聊点学术AI病理+量化病理方案设计【前言】早期，人们就发现在细胞的生命活动中，DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等，都涉及基因-蛋白质相互作用，很多生理学家都探讨了这种现象的发生过程。近年来，随着研究的深入，很多医学研究者已经将目光投向了基因-蛋白相互作用，期望在此水平上，另辟蹊径，深入分析癌症、心血管疾病、中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路和发生机制。染色质免疫共沉淀（ChIP）作为目前为止唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的实验方法，深得人心。很多人都希望接触和掌握此实验技术，希望从组蛋白修饰、转录调控、凋亡等角度深入研究病变机制，进而开发相应的药物。总之，ChIP是一个有效且重要的实验技术。下面就来聊聊它。【正文】能够与DNA结合的蛋白有多种，主要分为组蛋白和非组蛋白。一方面，染色体是由组蛋白和DNA构成的，组蛋白作为染色体的结构蛋白，可以与DNA形成核小体，组蛋白与DNA的结合关系是固定存在的，因此组蛋白的修饰作用成为研究的关键。NaCl可解除组蛋白和DNA的交联关系。（核小体结构图）另一方面，非组蛋白多是参与DNA复制、mRNA转录过程的一些功能蛋白，包括解链酶、切割酶、转录激活蛋白等等，它们与DNA、mRNA的结合关系是瞬时的，发挥完作用可能就及时脱离开了。ChIP实验原理：在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分5步：（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联；（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；（5）DNA 纯化回收；（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。因各试剂商提供的ChIP试剂盒操作参差不齐，因此实验的具体步骤不再展开，大家只需要按照手头上的试剂盒操作说明严格操作即可，但是核心步骤基本符合。接下来的内容主要是注意事项。注意事项想要做好ChIP实验，必须要控制好6个方面，包括培养基内活细胞数量、交联时间长短、消化后的片段大小、抗体的种类和特异性、常规实验操作技术等多种因素影响。想要控制这些过程，最核心的就是全面设置对照组。下面逐个做说明。1. 活细胞数量活细胞计数后，如果最终用于ChIP实验的细胞数量太高，将直接导致甲醛交联时间增加，间接导致细胞数量/微球菌核酸酶比例增大，这些均可造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp），实验处理过程中极易丢失这些片段，最终也会造成PCR检测困难或失败。最佳的DNA片段长度是150bp-300bp。相反，如果过细胞数量太少，则导致细胞数量/微球菌核酸酶比例减小，最终得到的DNA片段极可能小于100bp。总之，你所研究的DNA-蛋白丰度直接决定了ChIP实验所需的细胞数量，没有固定的数量标准，这些都需要预实验充分摸索。2. 甲醛交联时间1%终浓度的甲醛交联时间推荐5-60分钟。时间过久，会造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp）。时间太短，会导致交联不完全，实验过程中导致一部分的DNA-蛋白质复合物分离，最终分析的结果必然是不准确的。3. 设置对照组ChIP实验内对照：染色质断裂后，须按一定比例留取部分染色质溶液，此Input DNA（断裂后的基因组DNA）作为ChIP实验的内对照。内对照不仅可以验证染色质断裂的效果。如果按照取样比例换算，还可以根据Input DNA中靶序列的含量和染色质沉淀中的靶序列含量，推算ChIP实验效率，所以Input内对照是必须要设置的。阳性抗体对照：目的抗体沉淀DNA-蛋白复合物时，必须需设置阳性抗体对照组。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的、各物种之间比较保守的蛋白抗体，常用组蛋白抗体。抗体阴性对照：目的抗体沉淀蛋白DNA复合物时，必须需设置阴性抗体对照组。阴性对照所使用的抗体可以选择目的蛋白抗体宿主的血清蛋白。4. 目标蛋白抗体ChIP实验中与一般的抗原-抗体免疫反应实验不太一样。常规实验如western blot、蛋白质免疫共沉淀等，抗原上只要存在与抗体结合的位点，则二者的免疫反应基本不受到蛋白质空间结构影响。（参见往期内容：①.全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。② Co-IP免疫共沉淀）ChIP实验中，染色质沉淀步骤时，蛋白和DNA处在交联状态，目标蛋白的结合位点形成空间阻碍，导致抗体无法与目标蛋白结合形成复合物。因此，能力够做western blot、蛋白质免疫共沉淀实验的抗体不一定能够做ChIP实验，一定一定要使用已经过ChIP验证的抗体，否则实验必然失败。此外，抗体的浓度、孵育时间、孵育温度需要根据目标蛋白的丰度决定。目标蛋白丰度较低时，可能需要调整活细胞数量、过夜4℃孵育等。5. 常规实验操作ChIP实验过程较长，过程繁琐，需要反复的洗柱、离心、吸液、换管、孵育、震荡。操作说起来很简单，但是每一步都需要小心操作，非常考验基本功，希望大家多多注意。6. 实验结果分析对于Input DNA组，采用1.8%琼脂糖凝胶电泳，结果应该是片段集中于150bp到350bp之间，这样长度的DNA片段才是符合要求的。如下：进一步，内对照组、阴性抗体对照组、阳性抗体对照组的纯化DNA先采用PCR扩增，随后通过1.8%琼脂糖凝胶电泳，得到的结果应该是这样的：空白对照组无条带、阴性抗体对照组条带若或无、内对照组强条带、阳性对照组看到强条带。只有这样的结果才是成功的。后续才能进行RT-PCR实验。全文结束更多内容可搜索微信公众号“聊点学术”发布于 2020-04-13 21:51分子生物学染色质脱氧核糖核酸（DNA）赞同 19318 条评论分享喜欢收藏申请

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-seq_百度百科网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心CHIP-seq播报讨论上传视频研究体内蛋白质与DNA相互作用收藏查看我的收藏0有用+10ChIP-seq，指的是结合位点分析法，作为研究体内蛋白质与DNA相互作用。染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。中文名结合位点分析法外文名Chromatin Immunoprecipitation，ChIP简称ChIP-seq作用研究体内蛋白质与DNA相互作用技术支持染色质免疫共沉淀技术主要应用转录因子结合位点、组蛋白特异性目录1介绍▪实验流程▪生物信息分析流程2研究内容▪测序▪基本数据分析▪高级数据分析3应用领域4案例分析介绍播报编辑实验流程（1）甲醛交联整个细胞系（组织），即将目标蛋白与染色质连结起来；（2）分离基因组DNA，并用超声波将其打断成一定长度的小片段；（3）添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体；（4）去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序；（5）将准备好的样本进行深度测序。 [1]实验流程示意图 [2]生物信息分析流程（1）将测序得到的短序列片段匹配到参考基因组序列上。（2）有一部分短序列不能匹配到参考基因组上，有可能是未知的基因组序列；另一部分是能够匹配到基因组上的短序列，通常要对这些短序列进行覆盖度计算。（3）从匹配到基因组上的短序列中进行富集区域的扫描。通常扫描到的富集区即被认为是蛋白质与DNA相互结合的区域（也有假阳性位点等的影响）。（4）对扫描到的富集区做深度分析，包括基因，GO注释，利用基因浏览器进行可视化浏览，研究与基因结构的关系等。生物信息分析流程示意图 [3]研究内容播报编辑测序对客户提供的ChIP样品（如果有阴阳参启动子区域或DNA序列的）进行定量检测，检测合格后进行测序文库构建、DNA成簇（Cluster generation）扩增、高通量测序。基本数据分析数据产出统计：对测序结果进行图像识别（Base calling），去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列（Reads）长度、Reads数量、数据产量。高级数据分析标准高级数据分析内容包括：（1）ChIP-Seq序列与参考序列比对；（2）Peak calling：统计样品Peak信息（峰检测及计数、平均峰长度、峰长中位数）；（3）统计样品Uniquely mapped reads在基因上、基因间区的分布情况及覆盖深度；（4）给出每个样品Peak关联基因列表及GO功能注释；（5）在多个样品间，对与Peak关联基因做差异分析。技术特点应用领域播报编辑由于ChIP-Seq的数据是DNA测序的结果，为研究者提供了进一步深度挖掘生物信息的资源，研究者可以在以下几方面展开研究：（1）判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰；（2）检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位；（3）研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系；（4）CTCF转录因子研究。案例分析播报编辑ChIP-Seq案例研究Ellen Markljung等利用ChIP-Seq技术，发现：家猪IGF2基因（编码Insulin-like growth factor 2）第三内含子单碱基G→A的替换，导致抑制因子ZBED6在该基因上结合位点的丧失，从而使IGF2在骨骼肌中上调表达（表达量是正常情况的3倍），这一突变主要影响肌肉生长（提高了骨骼肌的数量，因此猪肉产量提高了3~4%）、心脏增大和脂肪沉积。ZBED6基因与ZBED6蛋白ZBED6基因：是失去转座功能的转座子，在所有哺乳动物中位于ZC3H11A基因第一内含子中；该基因在小鼠、大鼠、人、猩猩、狗、马、家猪中高度保守。Real-time-PCR分析显示，小鼠Zbed6 mRNA在脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、脾、尾和睾丸组织有不同程度地表达。ZBED6蛋白是首次报道。ZBED6蛋白含有2个BED结构域和1个hATC二聚结构域；第61~80位和第231~248位氨基酸残基是2个细胞核定位信号（富Lys-Arg区段，KKKRKKGLRIKGKRRRKKLI）。该蛋白在哺乳动物中高度保守，尤其是DNA结合BED结构域，在26个物种中（包括家猪）显示出~100%相似性。ZBED6蛋白作为抑制因子调控基因表达的方式用siRNA将小鼠C2C12成肌细胞中的Zbed6基因沉默后的相关实验结果，证实了ZBED6蛋白作为抑制因子是通过与位于Igf2基因第三内含子中的QTN（Quantitative trait nucleotide）位点结合来抑制Igf2基因的表达。当Zbed6基因沉默后，Igf2基因的表达量升高、细胞增殖（肌管形成）加快、创伤愈合加快。为了研究ZBED6蛋白作用靶点（Igf2基因及其下游基因），作者采用ChIP-Seq技术对小鼠C2C12成肌细胞进行分析。AB SOLiD测序得到：①24million reads（比对到小鼠基因组上），2,499 Peaks；大多数峰（Peaks）集中在Igf2基因内含子中的QTN位点，即，QTN位点是ZBED6蛋白在基因组上的主要结合位点（图1）。②GO注释分析发现，ZBED6蛋白的1200个作用靶点起着发育、转录调控、细胞分化等作用（图2）。其中，262个靶基因编码转录因子，36个含有Homeobox结构域，26个属于bHLH（basic helix-loop-helix）家族，10个属于FOX家族，8个细胞核受体，7个属于SOX家族（图3）。综上所述，IGF2基因突变的家猪和Zbed6基因沉默的小鼠C2C12成肌细胞的表型效应、高度的序列保守、核定位、广泛的组织分布、许多靶基因有重要的生物学功能，这一系列现象说明：在哺乳动物中，ZBED6是一个重要的转录因子，影响着发育、细胞增殖和生长。图1 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（A）Igf2基因内含子QTN位点ChIP-Seq Peak分布图1图2 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（E）Gene Ontology分类图2图3 小鼠C2C12细胞ChIP-Seq结果（F）ZBED6蛋白结合的转录因子家族图3新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号京公网安备110000020000

CHIP中文(简体)翻译：剑桥词典

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chip 在英语-中文（简体）词典中的翻译

chipnoun uk

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/tʃɪp/ us

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/tʃɪp/

chip noun

(FRIED FOOD)

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A1 [ C usually plural ] UK (US French fry) a long, thin piece of potato that is fried and usually eaten hot

炸薯条，油炸土豆条

fish and chips

炸鱼加土豆条

beans/egg/sausage and chips

豆子／鸡蛋／香肠加薯条

oven chips (= chips that are baked in an oven rather than fried)

烤薯条

A2 [ C usually plural ] US (US also potato chip); (UK (potato) crisp) a very thin, often round piece of fried potato, sometimes with a flavour added, sold especially in plastic bags

炸薯片

a bag of chips

一包炸薯片

[ C usually plural ] a thin slice of fried maize, banana, or other food that is eaten cold

炸玉米片（或香蕉片等）

tortilla chips and salsa

辣沙司佐玉米脆片

banana chips

炸香蕉片

更多范例减少例句Cod and chips, please.He consumes vast quantities of chips with every meal.Joe demolished an enormous plateful of sausages and chips.The children seem to exist on a diet of burgers and chips.I've just bought a deep-fat fryer for cooking chips.

chip noun

(COMPUTER PART)

B2 [ C ] (also microchip) a very small piece of semiconductor, especially in a computer, that contains extremely small electronic circuits and devices, and can perform particular operations

（尤指计算机的）集成电路片，芯片

a silicon chip

硅芯片

更多范例减少例句The computer chip compresses and decompresses a colour image in less than a second.The invention of the silicon chip was a landmark in the history of the computer.The silicon chip is a classic example of the benefits of miniaturization.Using a single chip reduces (the) noise on the output signal by 90%.We use a Pentium chip.

chip noun

(PIECE)

[ C ] a small piece that has been broken off a larger object, or the mark left on an object such as a cup, plate, etc. where a small piece has been broken off it

（脱落的）碎屑，碎片;（杯、盘等的）缺口

wood chips

木屑

Polly fell and knocked a chip out of her front tooth.

波莉摔了一跤，磕掉了一小块门牙。

This mug's got a chip in it/out of it.

这个缸子上有个豁口。

chip noun

(PLASTIC COIN)

[ C ] a small plastic disc used to represent a particular amount of money in gambling

（作赌注用的）筹码

figurative The hostages are being held as a bargaining chip by terrorist organizations.

恐怖组织扣押了人质作为讨价还价的筹码。

chip noun

(SPORT)

[ C ] a kick in football or a hit in golf, in which the ball goes high into the air for a short time

（足球的）挑球;（高尔夫球的）轻击短打

His splendid chip from the 18 yard line caught the goalkeeper off his line.

他从离球门18码处一脚漂亮的跳球，对方守门员没有站在球门线上，被打了个措手不及。

习语

a chip off the old block

have a chip on your shoulder

have had your chips

when the chips are down

chipverb [ I or T ] uk

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/tʃɪp/ us

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/tʃɪp/ -pp-

chip verb [I or T]

(BREAK)

to break a small piece off something by accident

打破；弄缺；（使）掉碎片

I wish my nail polish wouldn't keep chipping.

我希望我的指甲油不要老掉。

He's chipped a bone in his wrist.

他腕关节有一块骨头裂了。

chip verb [I or T]

(KICK/HIT)

to kick a football or hit a golf ball high into the air for a short distance.

（足球）挑球;（高尔夫球）轻击短打

Berbatov managed to sidestep a tackle and chip the keeper.

贝尔巴托夫躲过铲球，挑球越过了守门员。

短语动词

chip (something) in

chip in

(chip在剑桥英语-中文（简体）词典的翻译 © Cambridge University Press)

chip的例句

chip

The production of efficient neural chips for networking has taxed artificial intelligence workers for nearly a decade.

来自 Cambridge English Corpus

Structural adjustment policies, it is argued, have chipped away at the peasantry's economic viability, social coherence and class position.

来自 Cambridge English Corpus

Reflectance spectra were measured for small rock chips (a few millimetres across), while emittance spectra were measured for the whole rock sample (y2 cm across).

来自 Cambridge English Corpus

In expression analysis or expression profiling, microarrays and gene chips analyze or profile gene expression.

来自 Cambridge English Corpus

After transaction information is received, through the computer, each entry player (young) can compute the chips remaining on hand (consume).

来自 Cambridge English Corpus

You will have the opportunity to buy "chips," sell "chips," and make predictions of what will happen in the future.

来自 Cambridge English Corpus

Unfortunately, the complexity of modern chips leads to proofs which are beyond the capabilities of current automatic theorem provers.

来自 Cambridge English Corpus

If so, which of the chips is unique green?

来自 Cambridge English Corpus

示例中的观点不代表剑桥词典编辑、剑桥大学出版社和其许可证颁发者的观点。

A1,A2,B2

chip的翻译

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油炸食品, 炸薯條, 炸薯片…

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patata frita, papa frita, patata frita de bolsa…

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batata frita, batatinha frita em saco, batata chips…

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बटाट्याच्या तळलेल्या पातळ लांब फोडी, बटाट्याच्या पातळ गोलाकार तळलेल्या चकत्या. यात वेगवेगळ्या चवींसाठी इतर स्वाद मिसळतात. ह्या विशेषतः प्लॅस्टिकच्या पिशव्यां मधून विकतात., मका…

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フライドポテト, ポテトチップ, （コンピュータ）チップ…

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cips, kızarmış patates cipsi, çip…

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chip [feminine], éclat [masculine], fragment [masculine]…

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patata fregida (llarga), patata fregida (de bossa), xip…

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afsplinteren, schilfer, friet…

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ஒரு நீண்ட, மெல்லிய துண்டு உருளைக்கிழங்கு வறுத்த மற்றும் பொதுவாக சூடாக சாப்பிடப்படுகிறது, வறுத்த உருளைக்கிழங்கின் மிக மெல்லிய…

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चिप्स, (आलू के) चिप्स, (तले हुए मक्का…

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બટાકાની કાતરી, ચિપ્સ, બટાટાના મોટાભાગે ગોળ અને કાગળ જેવા પાતળા ટુકડા…

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slå en flis af, slå skår i, gå i stykker…

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slå en flisa ur, hack, pommes frites…

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serpih, sumbing, kentang goreng…

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anschlagen, angeschlagene Stelle, die Pommes frites…

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chips [masculine], hakk [neuter], bit [masculine]…

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چِپ (آلو کی پتلی لمبی تلی ہوئی قاشیں), چِپ (آلو کی انتہائی پتلی، گول تلی ہوئی قتلی), کیلے اور مکئی وغیرہ کی چپ…

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відколюватися, розбиватися, місце…

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ломтик жареного картофеля, чипсы, чип…

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చిప్, నూనెలో వేయించిన సన్న, పొడవు ఆలుగడ్డ ముక్క. ఎక్కువగా వేడిగా తింటారు.…

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أصْبَع بَطاطاس مَقْليّة, رُقاقة بَطاطِس (شيبسي), رُقاقة لِحِفْظ المَعْلومات في الحاسوب…

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আলুর লম্বা এবং পাতলা টুকরো যা গরম গরম ভেজে খাওয়া হয়, ভাজা আলুর পাতলা এবং গোল টুকরো, কখনও কখনও তাতে স্বাদ ও গন্ধ যোগ করা হয় আর সেগুলি বিশেষত প্লাস্টিকের থলিতে বিক্রি করা হয়…

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uštípnout, odštípnout, otlučené místo…

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pecah sedikit, sumbing, pecahan…

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กระเทาะ, เศษที่แตกออก, มันฝรั่งทอดแผ่นบางๆ…

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làm sứt, chỗ sứt, khoai tây mỏng rán…

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frytka, chips, procek…

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감자 튀김, (컴퓨터) 칩, 이가 빠지게 하다…

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patatina fritta, chip, scheggiare…

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惯用语

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“每日一词”

healthspan

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/ˈhelθ.spæn/

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/ˈhelθ.spæn/

the number of years that someone lives or can expect to live in reasonably good health

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如何评价上海交通大学主编的学术期刊《Chip》？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册上海交通大学期刊芯片（集成电路）学术期刊集成电路如何评价上海交通大学主编的学术期刊《Chip》？[图片] 新刊Chip是全球唯一聚焦芯片领域的综合性国际期刊，关注集成电路、微纳光子学、凝聚态物理学、量子物理学、人工智能、数据科学等领域芯片化集成化…显示全部关注者4被浏览5,867关注问题写回答邀请回答好问题添加评论分享2 个回答默认排序王图科技已认证账号关注学术期刊介绍：Chip期刊网址： Chip | Journal | ScienceDirect.com by ElsevierChip，是由上海交通大学与Elsevier集团合作出版，全球唯一聚焦芯片类研究的综合性国际期刊，目前已入选由中国科协、教育部、科技部、中科院等单位联合实施的「中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目」，为科技部鼓励发表「三类高质量论文」期刊之一。Chip秉承创刊理念: All About Chip，聚焦芯片，兼容并包，旨在发表与芯片相关的各科研领域尖端突破性成果，助力未来芯片科技发展。期刊关注领域涵盖了集成电路、微纳光子学、凝聚态物理学、量子物理学、人工智能、数据科学等领域芯片化集成化的科学研究与应用实现的各个方面。迄今为止，Chip已在其编委会汇集了来自14个国家的70名世界知名专家学者，其中包括多名中外院士及IEEE、ACM、Optica等知名国际学会终身会士（Fellow）。Ring-VCO-based phase-locked loops for clock generation –design considerations and state-of-the-art：电子科技大学杨世恒和澳门大学Pui-In Mak（麦沛然）团队联合撰文，从不同性能指标切入，基于不同时钟架构，系统性阐述了该领域的相关设计技术，讨论了现有工作的局限性并提出了未来的研究发展方向。同时，作者在本文中还提出了一种更全面的品质因子来综合评价基于环形振荡器锁相环的性能。本文第一作者为杨世恒，通讯作者为杨世恒、殷俊、Pui-In Mak。本文被选为当期封面主题文章以及Featured in Chip编辑特选文章之一。王图科研服务，专注学术的设计服务品牌，专业从事医学、生物学、化学与材料科学等领域的科学可视化工作，为高校与科研院所、高新技术企业提供科研绘图、学术答辩ppt美化服务、原理动画和宣传视频设计服务，助力科研工作者更好的展示与呈现；秉承着“服务科研，助力科研”的理念，以理工科背景的项目顾问和专业设计师组成的设计团队已先后为上百所高校、院所，千余位老师提供设计服务，助力老师在论文、项目申请、人才答辩、成果展示、科技成果转化等多应用场景有更好的视觉呈现。发布于 2023-07-15 18:39赞同 1添加评论分享收藏喜欢收起停停停关注可能到10吗发布于 2023-02-11 07:53赞同2 条评论分享收藏喜欢收起

先进的染色质免疫沉淀技术指南ChIP 2.0| Abcam中文官网

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ChIP 2.0：先进的染色质免疫沉淀技术指南

ChIP 资源

ChIP 网络研讨会的应用

超越 ChIP 研究：染色体构象捕获的进化

本指南概述了基于 ChIP 的最先进技术，并描述了这些技术的应用如何让人们对表观遗传机制产生新的认识。

染色质免疫沉淀（ChIP）是现代染色质分析技术的基础。ChIP 的中心法则是利用一种靶向目的蛋白或组蛋白修饰的抗体，下拉与之关联的 DNA 区域。ChIP 的适应性和多功能性使其能够用于解决各种研究问题。多功能性表现在两方面：抗体选择的多样性和技术的多样性（qPCR、微阵列、测序等）（Collas，2010）。ChIP 与微阵列（ChIP-chip）的耦合是我们理解人类基因组的关键（Kim 等人，2005 年）。ChIP-seq 有助于 ENCODE 项目的开展，该项目绘制了更多的人类基因组（Landt 等人，2012 年）。此外，数据分析技术的创新为数据集的再分析或整合提供了可能（Klein 等人，2014 年）。这些操作可以发现新的、通常更可靠的信息。传统的 ChIP 充当了一个跳板的角色，基于此开发出了新的应用类型，这些类型通常将 ChIP 与其他技术结合，以解决不同的生物学问题。交联染色质的限制性消化可实现相互作用片段的连接。这可以用来确定基因组的三维组织。ChIP 还可以与重亚硫酸盐转化等表观遗传学技术相结合，以探讨组蛋白修饰和 DNA 甲基化之间的相互作用。点击下方链接，了解有关基于 ChIP 的最新技术的更多信息。ChIP-loopChIA-PETChIP-exoChIP-BS-seq 与 BisChIP-seq补充阅读参考文献

ChIP-loopChIP-loop 检测由特定目的蛋白介导的 DNA-DNA 相互作用。这一操作通过在相对标准的染色质构象捕获（3C）方案中加入免疫沉淀（IP）步骤来实现：细胞经甲醛交联后进行染色质分离和限制性消化。使用抗目的蛋白的抗体对交联的染色质进行免疫沉淀。连接粘性 DNA 片段末端，此时染色质片段仍与抗体结合，交联反转，DNA 纯化。然后利用 PCR 可以检测到目的特异性 DNA-DNA 相互作用，结果证实，目的蛋白质介导了预测的 DNA-DNA 相互作用。相较 ChIP 或 3C 而言，ChIP-loop 的主要优势为特异性。其一，相较简单的 3C 检测方法，通过 IP 去除大量的基因组 DNA 能够降低背景噪音。此外，通过对特定目标蛋白进行靶向分析，仅检测到特异性、生物学相关的相互作用。也有观点认为，ChIP-loop 存在一项不足之处，其本身信息量可能并不大，应与 ChIP 数据相互参照。例如，如果与 ChIP-loop 相互作用的 DNA 在 ChIP 实验中没有同时富集，那么相互作用不应该被视为有效的相互作用（Simonis 等人，2007 年）。2005 年，研究人员首次将 ChIP 和 3C 结合起来研究 Rhett 综合征的小鼠模型（Horike 等人，2005 年）。这些研究人员发现，沉默-染色质环的形成对于 Dlx50Dlx6 位点的功能非常重要。他们进一步发现，这一染色质环是由 MECP2 介导的，这种相互作用在 Rhett 综合征个体中丢失。ChIP-loop 非常适合检测转录因子介导的 DNA 环，该转录因子是 Kcnq5 位点染色质环结构的主要调控因子。ChIP-loop 提示和技巧通过使用充足的起始原料，将连接偏倚降至最低。.在 DNA 浓缩于小体积时进行连接，染色质片段之间会发生不合需要的交叉连接。如果可能，仅使用 ChIP 进行确认。如上所述，交叉参照 ChIP-loop 与 ChIP 数据，大大降低了 ChIP-loop 检测中的假阳性结果。使用适当的对照品。建立含有等量连接产物的对照品模板。确定已知距离增加位点之间的相互作用频率，以估计随机相互作用。比较两种条件时，确定预期在两种状态下相同的区域的相互作用频率（类似于 Gapdh 或 ActB 如何用于基因表达分析）（Dekker，2006）。ChIA-PET通过末端配对标签测序法（ChIA-PET）进行的染色质相互作用分析是 ChIP 和 3C 技术的混合。ChIA-PEET 是 ChIP-loop 的高通量版本，能够通过整个基因组的目的蛋白检测长程染色质相互作用。方案的第一步与标准 ChIP 实验非常相似。使用甲醛交联细胞，连接整合的 DNA 区域和蛋白质。使用限制性内切酶消化染色质（或对染色质进行超声处理，参见提示和技巧），并用抗目的蛋白的抗体进行下拉。在连接过程中，加入连接序列，将 I 型限制性内切酶识别位点引入 DNA（Zhang 等人，2012年）。这些位点允许随后通过双端测序分离连接点。这样就创造了一个只有杂交的、相互作用的 DNA 片段的库。该库在下一代平台上测序，既可识别相互作用的区域，也可量化其相互作用的频率。ChIA-PET 为研究人员提供了涉及目的蛋白的全基因组相互作用。与同类技术相比，ChIA-PET 有许多优点。ChIP 的使用减少了待测序的 DNA 量，降低了复杂性，增加了测序反应的特异性。ChIA-PET 适用于所有基于标签的下一代平台（Roche 454 焦磷酸测序、SOLiD、Helicos 等）。如果有合适的抗体，ChIA-PET 可以用来检测任何蛋白质的相互作用。与所有 ChIP 技术一样，ChIA-PET 也受到抗体特异性的限制。同样受限于已知的基因组，因为调用必须映射回参考基因组。最后，虽然 ChIA-PET 可以确定蛋白是否存在于相互作用的复合物中，但它不能确定该蛋白是否真正介导了相互作用。例如，该蛋白可能与另外两个自身结合 DNA 的蛋白相结合。

ChIA-PET 工作流程。摘自：Zhang 等人，Nature（2013 年 11 月）。Fullwood 等人在 2009 年的一篇论文中引入了 ChIA-PET。这些研究人员开发了 ChIA-PET，用于绘制人类细胞中雌激素受体 α（ER-alpha）的结合位点。他们发现，ER-α 介导了基因启动子处长距离成环的形成，将基因聚在一起进行协调转录。ChIA-PET 还被用于表征其他转录因子（如 CTCF）的结合动力学（Li 等人，2013 年）。Li 等人发现 CTCF 可能在组织最近确定的染色质拓扑结构域中发挥作用。Chen 等人（2013 年）使用 ChIA-PET 检测了 miRNA 调控，并发现 miRNA 的表达在大的染色质区域是协调的。ChIA-PET 提示和技巧使用足量的起始原料。ChIP 步骤对于生成 ChIA-PET 库至关重要。至少需要 100 ng 的 ChIP DNA 才能生成足够复杂的 ChIA-PET 库。如果使用培养的细胞，至少使用 108 个细胞才能获得 100-300 ng 的 ChIP DNA（需要针对细胞类型和目的蛋白优化 IP）。超声处理或限制性内切酶消化：慎重选择。超声处理避开了使用限制性内切酶缩短蛋白交联染色质的序列偏倚和局限性。同时提高了分辨率；然而，超声处理条件相当苛刻，并且可以导致长程相互作用损失。如果您的实验依赖于长程相互作用，则可考虑限制性消化。如果存在序列偏倚和分离度问题，则可考虑采用超声处理。分析非常复杂，需适应另一个 ChIP 程序，或使用以前开发的软件。开发 ChIA-PET 的同一研究团队提供了用于分析的软件（Li 等人，2010 年）。ChIP-exo对传统 ChIP 进行非常细微的修改就可以使 ChIP-exo 以单核苷酸分辨率检测蛋白结合。ChIP-exo 使用限制性酶切和新一代测序，以高分辨率确定全基因组蛋白结合。首先将细胞甲醛交联，剪切并分离染色质。用抗目的 DNA 结合蛋白的抗体进行 IP，接着将接头连接到 DNA 片段上。然后用 λ 5’→3’ 外切酶消化 DNA。核酸外切酶去除蛋白质-DNA 复合物中突出的所有 5’ 末端 DNA，仅留下与蛋白质结合的 DNA 和 3’ 末端（Rhee 和 Pugh，2012a）。交联逆转，DNA 扩增，然后将另一个接头连接到 5’ 端。在新一代测序之后，可识别与第 2 个接头相邻的序列。这些序列是目的蛋白的结合位点。与传统 ChIP 相比，ChIP-exo 有许多优点。最明显的是，ChIP-exo 的分辨率比几乎所有其他基于 ChIP 的技术都要高。实现的单核苷酸分辨率在许多不同的 DNA 结合蛋白中保持稳健（Rhee 和 Pugh，2011 年；Rhee 和 Pugh，2012a）。最重要的是，在实现高实验分辨率和规模的同时不会伴随出现类似技术所存在的缺点，特别是与全基因组方法相关的噪音。

ChIP-exo 工作流程。摘自：Rhee 和 Pugh，现行分子生物学方案（2012 年 10 月）。DNA 消化步骤大大降低了噪音：所有非蛋白结合的 DNA 都被 λ 外切酶消化。还可以使用另外一种单链特异性核酸外切酶（如 RecJ）更有效地消化背景 DNA。这种 DNA 的去除大大降低了噪音，因此要求测序深度，并能降低成本。另外一项主要优点是敏感性。与其他技术相比，ChIP-exo 可检测较弱的 DNA-蛋白质相互作用，从而发现更多生物学相关的相互作用（Rhee 和 Pugh，2011 年）。ChIP-exo 唯一的实质性缺点与单个蛋白的多重结合事件有关。如果一个蛋白同时结合多个 DNA 位点，形成一个环或其他 3D 结构，则无法检测到这种结构；任何和所有多重结合事件都会丢失。ChIP-exo 仅仅读取这些事件中的单一结合事件。这个问题可能取决于蛋白质，因为复杂环状结构在转录中的意义越来越明显（Gibcus 和 Dekker，2013 年）。Rhee 和 Pugh 在 2011 年的 Cell 论文中引用了 ChIP-exo 技术。这些研究人员检测了酵母转录因子 Reb1、Gal4、Phd1、Rap1 和人类 CTCF 的结合模式。他们发现，每个酵母转录因子都有多种结合模式和机制。例如，他们发现许多低亲和力位点具有高占位。这表明仅通过序列不能预测因子结合。成簇位点比孤立位点结合的因子更多这一发现在某种程度上对此进行了解释，表明包括高浓度和直接、间接合作在内的效应组合影响转录因子结合。在后续的一篇论文中，这些研究人员还使用 ChIP-exo 在被视为无 TATA 的启动子中识别了 TATA-box 样特征（Rhee 和 Pugh，2012b）。ChIP-exo 提示和技巧研究开始前评估分辨率是否至关重要。ChIP-exo 在几乎所有指标上都优于 ChIP-seq，但耗费人力和成本。如果额外的分辨率和更好的信噪比在您的实验中并非至关重要的部分，则可考虑采用 ChIP-seq 技术。考虑使用磁珠。Serandour 等人（参见补充阅读）修改了 Rhee 方案，以纳入磁珠的使用。与琼脂糖相比，磁珠能更好地下拉弱相互作用和大蛋白复合物。ChIP-BS-seq and BisChIP-seqChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 是两种几乎相同的技术，都用于结合 ChIP 和重亚硫酸盐测序。重亚硫酸盐转化也许是可用的最丰富的 DNA 甲基化技术。亚硫酸氢钠用化学方法将未修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶，同时确保甲基化的胞嘧啶完好（Frommer 等人，1992 年）。重亚硫酸盐测序结合了重亚硫酸盐处理和新一代测序平台，在全基因组范围内提供单核苷酸甲基化分辨率。结合 ChIP，5mC 信息可靶向携带特定组蛋白修饰或目标染色质结合蛋白的区域： ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 的第一步是针对目的蛋白或组蛋白修饰进行 ChIP。然后对样本进行尺寸选择和接头连接。连接顺序和类型以及大小选择方面存在微小差异。通过重亚硫酸盐处理库并在下一代平台上对库进行测序。使用生物信息学软件与参考序列进行比较后，获得了含有目标组蛋白修饰的区域的单核苷酸甲基化信息（Brinkman 等人，2012 年；Statham 等人，2012 年）。表观遗传标记的共同出现对它们的功能而言至关重要，这一点愈发清晰。各种标记协同作用，以调节基因表达，并且通常彼此共同调节（Ernst 等人，2011 年）。因此，在相同的生物样本中检查两个或更多的表观遗传标记可以深化对研究问题的理解。这是 ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 的关键优势。与传统的重亚硫酸盐测序相比，这两种技术还有另一个优势，那就是用于重亚硫酸盐测序的 DNA 减少。这意味着测序中需要的读数更少，大大降低了成本。但是，这确实也意味着需要大量的输入样本，因此 ChIP-BS-seq/BisChIP-seq 并不太适合低细胞计数的应用。这些技术还有另一个缺点，即实验的特异性由抗体的质量决定，这一点与所有基于抗体的技术一样。ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 由两个团队独立开发，发表在同一期的 Genome Research 上（Brinkman 等人，2012 年；Statham 等人，2012 年）。Brinkman 等人使用 ChIP-BS-seq 来观察组蛋白 H3 赖氨酸 27 三甲基化（H3K27me3）和 DNA 甲基化。他们发现 H3K27me3 和 DNA 甲基化在 CpG 岛是相互排斥的。Statham 等人使用 BisChIP-seq 检测了正常和癌变前列腺细胞中的 DNA 甲基化和 H3K27me3。令人惊讶的是，他们发现非甲基化和甲基化的 DNA 能够与 H3K27me3 区域相关联。这意味着 DNA 甲基化状态并不依赖于抑制性组蛋白标记的存在，这个假设被广泛接受。ChIP-BS-seq 和 BisChIP-seq 提示和技巧数据分析可能非常复杂。由于这些技术相对较新，因此没有专为 ChIP-BS-seq/BisChIP-seq 数据设计的软件。Statham 等人发布了他们创建的自定义管道，点击此处可以查看。调整参考序列，允许读取映射。将参考序列中的所有胞嘧啶替换为胸苷，以绘制转换后的重亚硫酸盐序列。补充阅读Collas P (2010). The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol, 45, 87-100.这篇综述描述了 ChIP 的基本原理及其许多衍生技术，重点介绍了每种技术与基本方案的不同之处。 Furey TS (2012). ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet, 13, 840-852.这篇综述重点介绍了 ChIP-seq 的原理，但也是其他相关技术的一个很好的资源。作者描述了每种技术的分析和数据输出差异。 Splinter E, de Wit E, van de Werken HJ, Klous P and de Laat W (2012). Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: from fixation to computation. Methods, 58, 221-230.这一章主要介绍了 3C 技术，还包括了 ChIP-loop 的基础和应用。 de Wit E and de Laat W (2012). A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev, 26, 11-24.Sajan SA and Hawkins RD (2012). Methods for identifying higher-order chromatin structure. Annu Rev Genomics Hum Genet, 13, 59-82.这些文章涵盖各种 ChIP 和 3C 技术，包括 ChIP-loop 和 ChIA-PET。他们还研究了每种技术的优缺点，以及这些技术如何与染色质分析的大图相匹配。 Serandour AA, Brown GD, Cohen JD and Carroll JS (2013). Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties. Genome Biol, 14, R147.这篇论文描述了 ChIP-exo 在常见的 Illumina 测序平台上使用的适应性。ChIP-exo 的适应性在所有指标上都优于 Illumina 上的 ChIP-seq，并且是专门为人体实验设计的。 Gao F, Ji G, Gao Z, Han X, Ye M, Yuan Z, Luo H, Huang X, Natarajan K, Wang J, Yang H and Zhang X (2014). Direct ChIP-bisulfite sequencing reveals the role of H3K27me3 mediating aberrant hypermethylation of promoter CpG islands in cancer cells. Genomics, 103, 204-210.这篇初级论文利用 ChIP-BS-seq 探索了 H3K27me3 和 H3K4me3 在 TCGA 初级癌细胞中调控 CpG 岛 DNA 甲基化的作用。参考文献Brinkman AB, Gu H, Bartels SJ, Zhang Y, Matarese F, Simmer F, Marks H, Bock C, Gnirke A, Meissner A and Stunnenberg HG (2012). Sequential ChIP-bisulfite sequencing enables direct genome-scale investigation of chromatin and DNA methylation cross-talk. Genome Res, 22, 1128-1138.Chen D, Fu LY, Zhang Z, Li G, Zhang H, Jiang L, Harrison AP, Shananan HP, Klukas C, Zhang HY, Ruan Y, Chen LL and Chen M (2014). Dissecting the chromatin interactome of microRNA genes. Nucleic Acids Res, 42, 3028-3043.Clark S, Harrison J, Paul C and Frommer M (1994). High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res, 22, 2990-2997.Collas P (2010). The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol, 45, 87-100.Dekker J (2006). The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods, 3, 17-21.Dekker J, Rippe K, Dekker M and Kleckner N (2002). Capturing chromosome conformation. Science, 295, 1306-1311.Ernst J, Kheradpour P, Mikkelsen TS, Shoresh N, Ward LD, Epstein CB, Zhang X, Wang L, Issner R, Coyne M, Ku M, Durham T, Kellis M, Bernstein BE (2011). Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature, 473, 43-49.Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collis CM, Watt F, Grigg GW, Molloy PL and Paul CL (1992). A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 1827-1831.Fullwood MJ, Liu MH, Pan YF, Liu J, Xu H, Mohamed YB, Orlov YL, Velkov S, Ho A, Mei PH, Chew EG, Huang PY, Welboren WJ, Han Y, Ooi HS, Ariyaratne PN, Vega VB, Luo Y, Tan PY, Choy PY, Wansa KD, Zhao B, Lim KS, Leow SC, Yow JS, Joseph R, Li H, Desai KV, Thomsen JS, Lee YK, Karuturi RK, Herve T, Bourque G, Stunnenberg HG, Ruan X, Cacheux-Rataboul V, Sung WK, Liu ET, Wei CL, Cheung E and Ruan Y (2009). An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome. Nature, 462, 58-64.Gibcus, JH and Dekker J (2013). The hierarchy of the 3D genome. Mol Cell, 49, 773-782.Horike S, Cai S, Miyano M, Cheng JF and Kohwi-Shigematsu T (2005). Loss of silent-chromatin looping and impaired imprinting of DLX5 in Rett syndrome. Nat Genet, 37, 31-40.Kim TH, Barrera LO, Zheng M, Qu C, Singer MA, Richmond TA, Wu Y, Green RD and Ren B (2005). A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature 436, 876-880.Klein HU, Schäfer M, Porse BT, Hasemann MS, Ickstadt K and Dugas M (2014). Integrative analysis of histone ChIP-seq and transcription data using Bayesian mixture models. Bioinformatics, 30, 1154-1162.Landt SG, Marinov GK, Kundaje A, Kheradpour P, Pauli F, Batzoglou S, Bernstein BE, Bickel P, Brown JB, Cayting P, Chen Y, DeSalvo G, Epstein C, Fisher-Aylor KI, Gerstein M, Gertz J, Hartemink AJ, Hoffman MM, Iyer VR, Jung YL, Karmaker S, Kellis M, Kharchenko PV, Li Q, Liu T, Liu XS, Ma L, Milosavljevic A, Myers RM, Park PJ, Pazin MJ, Perry MD, Raha D, Reddy TE, Rozowsky J, Shoresh N, Sidow A, Slattery M, Stamatoyannopoulos JA, Tolstorukov MY, White KP, Xi S, Farnham PJ, Lieb JD, Wold BJ and Snyder M (2012). ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res, 22, 1813-1831.Li G, Fullwood MJ, Xu H, Mulawadi FH, Velkov S, Vega V, Ariyaratne PN, Mohamed YB, Ooi HS, Tennakoon C, Wei CL, Ruan Y and Sung WK (2010). ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing. Genome Biol, 11, R22.Li Y, Huang W, Niu L, Umbach DM, Covo S and Li L (2013). Characterization of constitutive CTCF/cohesion loci: a possible role in establishing topological domains in mammalian genomes. BMC Genomics, 14, 553.Ren L, Wang Y, Shi M, Wang X, Yang Z and Zhao Z (2012). CTCF mediates the cell-type specific spatial organization of the Kcnq5 locus and the local gene regulation. PLoS One, 7, e31416.Rhee HS and Pugh BF (2011). Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell, 147, 1408-1419.Rhee HS and Pugh BF (2012a). ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy. Curr Protoc Mol Biol, Chapter 21, Unit 21.24.Rhee HS and Pugh BF (2012b). Genome-wide structure and organization of eukarytic pre-initiation complexes. Nature, 483, 295-301.Statham AL, Robinson MD, Song JZ, Coolen MW, Stirzaker C and Clark SJ (2012). Bisulfite sequencing of chromatin immunoprecipated DNA (BisChIP-seq) directly informs methylation status of histone-modified DNA. Genome Res, 22, 1120-1127.Zhang J, Poh HM, Peh SQ, Sia YY, Li G, Mulawadi FH, Goh Y, Fullwood MJ, Sung WK, Ruan X and Ruan Y (2012). ChIA-PET analysis of transcriptional chromatin interactions. Methods, 58, 289-299.Zhang Y, Wong CH, Birnbaum RY, Li G, Favaro R, Ngan CY, Lim J, Tai E, Poh HM, Wong E, Mulawadi FH, Sung WK, Nicolis S, Ahituv N, Ruan Y and Wei CL (2013). Chromatin connectively maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature, 504, 306-310.

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关键词：染色质免疫沉淀

来源：互联网

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真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着CHIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

染色体免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，在过去十年已经成为表观遗传信息研究的主要方法。这项技术帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰。

ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。

它的原理是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。

另一面，如用弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使IP成功，也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低温下进行实验。每次实验之前，首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。

ChIP的一般流程：

甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

具体操作流程：

第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。

2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次

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dxy_gm4sarl3

微球菌核酸酶实验DNA 电泳一直观察不到200bp 有人做过么？想交流一下 1 评论

莫想G5NP

请教各位大佬具体研磨液配制的比例是多少？

曼奇农场11

楼主，那么多注释没有写明白哦，谢谢分享楼主，那么多注释没有写明白哦，谢谢分享

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交联、染色质断裂、ChIP 抗体以及 N-ChIP 和 X-ChIP 之间的比较。由 Gurdon 研究所的 Andy Bannister 博士编辑。

了解以下 ChIP 技巧和诀窍后，查看更多 ChIP 检测/染色质免疫沉淀资源和产品，或直接获得重要的 ChIP 数据：- 经过仔细验证的 ChIP 抗体，包括重组兔单克隆抗体，旨在年复一年地提供完全相同的性能- 灵活的染色质提取试剂盒 ab117152，用于提取天然、交联、剪切或未剪切的染色质- 易于上手的 ChIP 试剂盒 ab500，或来自 ChIP 系列试剂盒产品的其他试剂盒。什么是 ChIP？ChIP 的原理很简单：选择性富集含有特定蛋白质的染色质组分。抗体用于免疫沉淀目标蛋白及其相关 DNA。接下来通过 PCR、微阵列或测序等进行回收与分析，找出蛋白质结合的基因组位点。ChIP 最常研究的染色质类型是常染色质。常染色质含有活性基因，并保持开放、疏松的结构，以便在转录、DNA 修复和基因复制中发挥重要作用。异染色质含有许多失活的基因，很难通过 ChIP 进行分析，主要原因在于其凝聚态和重复的 DNA 序列。ChIP 为何是一项非常有用的技术？ChIP 分析染色质及其相关因子之间相互作用的时空动态。该技术使我们能够绘制单个启动子每分钟的变化，或者在整个人类基因组中跟踪单个转录因子。必须记住的是，输出是分析细胞群产生的平均值。ChIP 是多功能的，可以让我们深入了解基因在其自然背景下如何被调控。ChIP 是如何工作的？ChIP 用于确定一个给定的蛋白质在体内是否与特定的 DNA 序列进行了结合。ChIP 程序包括以下步骤：总染色质的分离染色质的断裂（以实现分离）所得染色质片段的免疫沉淀分析免疫沉淀组分，以确定靶 DNA 序列相对于其在输入染色质中丰度的量。ChIP 是一种听起来有些令人生畏的技术，但只要拥有合适的工具，就可以掌握这一技术。如果您的实验室在 ChIP 技术方面还不成熟，您可以考虑使用一种试剂盒，例如 ChIP 试剂盒 ab500。ChIP 实验成功的有用技巧交联交联 DNA 和蛋白质通常需要在分析前稳定其相互作用。ChIP 可以通过两种不同的方式进行，取决于您是否选择交联您的染色质样本。如果您交联您的样本，那么该技术被称为交联 ChIP（X- ChIP），否则将被称为自然 ChIP（N-ChIP）。选择交联还是不交联？交联的目的是将目的抗原固定在其染色质结合位点上。组蛋白本身一般不需要交联，因为它们已经与 DNA 紧密相连。其他对 DNA 或组蛋白亲和力较弱的 DNA 结合蛋白可能需要交联。交联可以让它们保持在适当的位置，并避免蛋白质从染色质结合位点解离。距离您的目标相互作用 DNA 越远，无交联的 ChIP 效率就越低。用于组蛋白修饰的 ChIP 不太可能需要交联，但 DNA 结合复合物中包含的转录因子和蛋白质等非组蛋白可能需要交联。如何交联？使用甲醛，因为它形成的连接是可逆的。详见我们的 N-ChIP 和 X-ChIP 方案。UV 交联不合适，因为它是不可逆的。应该指出的是，甲醛的替代交联剂确实存在 — 如果研究人员需要在各种分子间距离上交联，这些替代交联剂可能有用。甲醛是一种非常好的 DNA-蛋白质交联剂，但由于尺寸小（2 Å），它并不是一种非常有效的蛋白质-蛋白质交联剂。因此，通常很难对不直接与 DNA 结合的蛋白质进行 ChIP 分析。可以过度交联吗？可以。交联是一个对时间要求严格的过程。交联通常只能进行几分钟。过度交联会导致多个问题，包括抗原可用性和超声效率降低。例如，抗原决定簇可能被掩盖或改变，影响抗体结合抗原的能力，进而导致您的样本中的材料减少。始终执行时间进程实验，以优化交联条件。我们建议将样本交联 2-30 分钟。加入甘氨酸淬灭甲醛，终止交联反应。为了进一步帮助 DNA 纯化，可通过蛋白酶 K 处理来破坏蛋白质和 DNA 之间的交联，蛋白酶 K 会裂解邻近脂肪族和芳香族氨基酸羧基的肽键。染色质断裂为了使抗体试剂易于进行相互作用，需要使染色质碎裂。为破碎染色质，您既可以超声处理染色质，也可以用微球菌核酸酶消化染色质。您选择的方法在很大程度上取决于所进行的 ChIP 实验的类型。无论您使用什么方法，每次设置实验时，一定要运行片段化时间过程。含酶消化的 N-ChIP用微球菌核酸酶进行酶消化足以破碎您的样本，以进行 N-ChIP。N-ChIP 不需要交联，因此不会对酶进入其靶标产生潜在影响。使用酶技术可以产生单个单体（约 175 个碱基对），在标准 ChIP 中提供最高的分辨率。然而，某些染色质结合剂，如转录因子，通常结合核小体间 DNA，因此纯化的单核小体不适合。另外，核小体是动态的，没有交联，它们可能在酶消化过程中重排。如果想要绘制基因组区域图，这是一个潜在的问题，必须使用合适的对照品来监测任何变化（定量 PCR 见检测对照品）。酶切不会产生染色质的随机切片。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有利，但对 DNA 的消化不均匀或不相同。结果可能不完全准确，因为某些位点可能被过度表达，而且一些数据可能会被遗漏。如何在消化中获得一致性？您购买原液酶后一定要等量分装，每次做实验时都要用新鲜的分装液运行一个新的时间过程。尽管在储存过程中酶的质量可能会随着时间的推移而发生变化，但相对而言，染色质制备期间的变异风险（压实度等）要高得多；一个染色质样本不应视为与之前的所有其他样本相同。做 N-ChIP 时，应进行 X-ChIP，作为对照实验，以评估由于没有交联而导致的任何动态和不必要的变化。X-ChIP 和超声通常情况下，进行 X-ChIP 时有必要作超声处理，因为甲醛交联限制了诸如微球菌核酸酶等酶对其靶标的访问，这意味着酶消化在交联样本方面通常无效。通常认为超声处理会产生随机大小的 DNA 片段，没有优先切割的基因组片段，但实际上很少观察到这种情况。超声处理产生的片段平均为 500-700 个碱基对（2-3 个核小体），通常比通过酶切产生的片段大。产生的片段大小直接影响 ChIP 程序的分辨率；大多数情况下，在 ChIP 中，能够很好地分辨高达 1.5 kb 的片段。尽管超声处理最适合 X-ChIP，酶消化对完全交联的样本无效，但需要温和或不完全交联时，微球菌核酸酶消化是有用的，它可以结合超声处理，提高分辨率。避免起泡，因为起泡会导致溶液内的能量转移减少，并降低超声效率。超声处理的染色质可在液氮中速冻，并在 -80℃ 条件下保存长达 2 个月。避免多次冻融。用于 ChIP 的抗体在 ChIP 中，抗体用于捕获蛋白质和相互作用的 DNA，理想情况下应充分表征。确保抗体在 ChIP 中工作。如果可用，使用已充分表征并标记为 ChIP 级的抗体。对于 N-ChIP，推荐使用蛋白质印迹中的肽竞争来表征抗体特异性。理想情况下，ChIP 的特异性抗体应该经过亲和纯化；然而，许多实验室将血清作为其抗体来源，然后克服严谨型缓冲液可能出现的背景问题。即使充分表征，也无法说明一个抗体是否会在 X-ChIP 中发挥作用，因为交联的影响可以达到戏剧性的程度，以至产生不同的表位，特定表位可能会丢失。如需检测一个未表征的抗体是否可以进行 ChIP，可以先用抗体进行 ChIP，然后用同样的抗体进行 western blot。没有 ChIP 级抗体？如果没有可用的抗体，那么在 IP 和 IHC 中工作的抗体就是合适的候选者。对于 N-ChIP，推荐使用蛋白质印迹中的肽竞争来表征抗体特异性。理想情况下，ChIP 的特异性抗体应该经过亲和纯化；然而，许多实验室将血清用作其抗体来源，再克服严格缓冲液可能出现的背景问题（参见其他常见问题）。用于组蛋白修饰的抗体需要彻底检测特异性，例如通过肽阵列检测。多克隆抗体与单克隆抗体单克隆抗体只能识别一个表位，而在多克隆抗体群中，会有许多识别不同表位的抗体。多克隆群体可降低所有特定表位被交联过程掩盖的可能性，因此在 X-ChIP 中出现阳性结果的机会更大。但是，单克隆抗体的批间一致性通常较高。我可以使用什么抗体对照品？作为该技术的阳性抗体对照，组蛋白 H3 三甲基 K4 (H3K4me3) 和三甲基 K9 (H3K9me3) 分别是研究活性基因和非活性基因时常用的阳性对照。请记住，这些抗体本身并不是阳性和阴性对照，因为对照取决于您正在研究的位点：如果在特定的目标位点没有 H3K4me3，那么全球最好的抗 H3K4me3 ChIP 级抗体将不会免疫沉淀来自该区域的任何东西，因此不是一个合适的阳性对照。作为阴性对照，使用识别非染色质表位的抗体，如抗 GFP 抗体。染色质重塑可能移动或移除特定位点的组蛋白，例如活性启动子，因此使用针对非修饰组蛋白（如组蛋白 H3）的对照抗体来检查特定基因组位点的核小体的保存。分析组蛋白修饰时，需要标准化到组蛋白内容物。这一操作可以用抗 H3 抗体 (ab1791) 完成。抗体对 ChIP 起作用，但信号较弱 — 我如何补救？第一步，您可以尝试不同类型的 ChIP。例如，如果您正在执行 N-ChIP，那么尝试 X-ChIP。或者，在不同的位置查看。可能存在抗原，但不在您正在观察的基因组位点上。如果可以的话，最好尝试不同的抗体，以找到在 ChIP 中效果最好的抗体。最后，目标表位可能在 X-ChIP 中被掩盖了：可能有必要进一步优化交联时间进程。我的 ChIP 实验应该用什么浓度的抗体？首次试验时，每使用 25-35 mg 纯单体，可使用 3-5 µg 抗体。如果您正在做定量 ChIP，那么最终您可能需要将一定量的染色质与等量的抗体进行匹配。与许多技术一样，如有可能，有必要在开始时优化抗体量。即使抗体能够将目的蛋白免疫沉淀在甲醛固定的染色质中，也并不意味着 ChIP 实验已经奏效，因为有可能您的目的蛋白没有与 DNA 交联。如果观察到高背景，可能需要额外清洗。另外，在免疫沉淀前，还可以用蛋白 A/G 微珠孵育 1 小时，从而预清除超声处理的染色质。在该附加步骤中去除与微珠的任何非特异性结合。检测定量 PCR 用对照品基因组的某些区域会比其他区域纯化得更好，一些核小体在酶促断裂过程中可能发生重排。因此，在起始物料以及纯化/碎裂物料的几个区域生成 PCR 引物，作为虚假结果的对照，至关重要。裂解起始细胞，制备起始物料，并取样用于与 ChIP 平行的控制区简单 PCR。数据在起始物料可能发生变化的情况下，应始终对起始物料的量进行数据标准化，以消除由于样本量不均匀而引入的误差。为了规范化您的数据，取最后的扩增子值并将其除以输入物料的扩增子值。对于组蛋白修饰，免疫沉淀的物料通常被标准化为相关的免疫沉淀组蛋白的输入量和数量。例如，带有 H3K4me3 抗体的 ChIP 将相对于输入量和 H3 免疫沉淀量表达。测量起始物料的数量（和质量）是有效解释结果的关键。其他常见问题ChIP 应该使用什么组蛋白对照样本？小牛胸腺组蛋白制剂应作为阳性对照组蛋白样本，用于 western blot 中抗体特异性的检查。免疫沉淀组蛋白修饰时，纯化的组蛋白 H3 和 H1 可以作为实验组蛋白制备质量的阳性对照（组蛋白 H1 通常用于 X-ChIP）。推荐使用何种缓冲液？使用的缓冲液越严格，结果越好（即缓冲液中盐和清洁剂的浓度越高，结果越干净）。必须为每一个新的 ChIP 实验优化缓冲液，因为必须在低背景和对目标的有害影响之间找到折中方法。NP-40 可作为去污剂，RIPA 也常用于 X-ChIP。还有哪些处理可能会影响我的 ChIP 结果？添加 TSA、丁酸盐或秋水仙胺一般不会影响 ChIP。请勿在高 rpm（不超过 6,000 rpm）下离心琼脂糖凝胶微珠，否则会压缩微珠并损坏微珠。一些抗体会受到浓度相对较低的 SDS 的影响。优势和缺点优势缺点N-ChIP可预测和可检测的抗体特异性对非组蛋白无效DNA 和蛋白质的高效沉淀选择性核酸酶消化可能会偏倚输入染色质高分辨率（175 bp/单体）核小体在消化过程中可能重排X-ChIP适用于非组蛋白与 DNA 弱结合或间接结合抗原表位破坏可能导致抗体结合无效交联可让核小体重排降至最低修复瞬态（人为）交互，以提供稳态水平的虚假图片适用于天然染色质难以制备的生物体（例如，酵母菌）通过超声处理法制备低分辨率染色质难以酶解消化的交联 DNA摘自 O’Neill 和 Turner，方法，2003 年，第 76-82 页共享您的 ChIP 提示邮箱: epigenetics@abcam.com查看我们的其他表观遗传学方案和技术。

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